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總結(jié)His抗體蛋白純化的常見問題及解決方法

更新時(shí)間:2022-01-04點(diǎn)擊次數(shù):2465
  His抗體能夠特異性識(shí)別His標(biāo)簽,可以用于定性定量檢測His融合蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位等。為了讓大家詳細(xì)的了解該抗體,下面小編就介紹一下標(biāo)簽抗體進(jìn)行蛋白純化常見的問題及解決方法。
  
  His抗體蛋白純化常見問題:
  
  一、蛋白不和介質(zhì)結(jié)合
  
  可能原因:超聲功率不合適(太大,蛋白碳化,太小,蛋白沒*釋放)
  
  解決方法:改變超聲功率或者其它方法破碎細(xì)胞。
  
  樣品或緩沖液不合適
  
  解決方法:確保緩沖液中螯合劑,還原劑,咪唑濃度不是很高。
  
  His標(biāo)簽暴露不*
  
  解決方法:在緩沖液中加變性劑(4-8M尿素,4-6M鹽酸胍),然后用IMAC介質(zhì)純化。
  
  His標(biāo)簽丟失
  
  解決方法:必要時(shí)增加His的個(gè)數(shù)并確保正確表達(dá),同時(shí)降低上樣速度,確保足夠的孵育時(shí)間。
  
  二、His抗體蛋白結(jié)合在介質(zhì)上洗脫困難
  
  1、可能原因:洗脫條件太溫和
  
  解決方法:增加洗脫咪唑濃度或降低pH。
  
  2、可能原因:蛋白沉積在介質(zhì)上
  
  解決方法:減少上樣量,優(yōu)化層析條件。
  
  3、可能原因:非特異性結(jié)合
  
  解決方法:緩沖液加2%TritonX-100和NaCl。
  
  三、洗脫峰雜質(zhì)多
  
  可能原因:非特異性結(jié)合,清洗不*,降解等。
  
  解決方法:純化過程加蛋白抑制劑防止降解,上樣完后要*清洗,加一定的NaCl和咪唑減少非特異性結(jié)合。
  
  四、使用幾次,介質(zhì)結(jié)合效率降低,柱效降低
  
  可能原因:介質(zhì)上沉積大量雜質(zhì)等
  
  解決方法:*清洗,IDA/IMAC脫鎳再生處理。
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